細胞學堂 | 脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染干貨分享
在我們的日常基礎實驗研究中后期，往往會進入到機制的研究，需要研究某個基因或者蛋白對細胞的表型或者功能的影響，大部分都會運用到轉(zhuǎn)染技術。
細胞轉(zhuǎn)染，是指將外源DNA或者RNA片段導入細胞中，從而使細胞獲得新的表型的過程。常見的細胞轉(zhuǎn)染的方法，主要有物理介導（電穿孔法、顯微注射和基因槍法等）、化學介導（磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法等）、生物介導（各種病毒介導的轉(zhuǎn)染等）三種方法。
評價轉(zhuǎn)染效果的好壞，主要看兩個方面：一是較高的轉(zhuǎn)染效率，二是較低的細胞毒性。由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件需要多次摸索優(yōu)化、難度較大，病毒法的成本較高，前期準備時間較長，所以現(xiàn)在很多普通細胞系，多采用脂質(zhì)體法。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是利用帶正電的陽離子脂質(zhì)體，與核酸通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復合物，同時也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。
由于這種轉(zhuǎn)染方法具有好的重現(xiàn)性和較高的轉(zhuǎn)染效率，不僅適用于貼壁細胞，對懸浮細胞也適用，所以目前使用的較多。不過需要通過預實驗來確定適當?shù)募毎臃N密度和轉(zhuǎn)染時間，選擇最佳的轉(zhuǎn)染條件。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗步驟（以lip2000為例）
1、 細胞準備
將處于對數(shù)生長期的細胞進行消化，接種到相應的培養(yǎng)皿或者孔板中， 根據(jù)細胞的生長快慢，來確定細胞的接種密度，使細胞轉(zhuǎn)染前的密度達到50%~70%，密度不易過大。
2、細胞轉(zhuǎn)染
吸去細胞培養(yǎng)皿/培養(yǎng)孔板中的舊培養(yǎng)基，用預溫PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗，去除殘留血清。更換無血清和雙抗的基礎培養(yǎng)基（6孔板2毫升/孔），放37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時準備轉(zhuǎn)染液，用滅菌后的EP管制備。以六孔板一個孔的量為例：
A液：用250μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;
B液：用250μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000。
分別將A液、B液輕輕混勻，室溫靜置5min，將B液全部加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。
將轉(zhuǎn)染混合液均勻滴加到每個孔中輕輕混勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h-6 h后，去除質(zhì)粒復合物，更換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前，應該摸一個最佳配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。
轉(zhuǎn)染操作小貼士
(1) 應使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^測量OD 值來確定DNA純度和濃度，OD值應介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染，都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。
(2) 混合時需動作輕柔。轉(zhuǎn)染時，小心輕柔地將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質(zhì)體失效。
(3) 根據(jù)實驗需求，提前計算好需用的總質(zhì)粒量和lipo2000量，大體積地制備，可以減少誤差。
(4) 細胞轉(zhuǎn)染中，使用的是無血清和雙抗的培養(yǎng)基。血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復合物的形成，而抗生素在轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性時，也會進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。
(5) 轉(zhuǎn)染后6h更換含血清的培養(yǎng)基，因為lipo2000具有一定毒性。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染也存在一定的弊端，目前已有文獻研究表明，脂質(zhì)體可能會抑制ATP酶活性，從而影響細胞的生理活動。盡管如此，目前學界暫時沒有其它更高效轉(zhuǎn)染方法。
3、觀察轉(zhuǎn)染的效果
在轉(zhuǎn)染后24 h，選擇合適的熒光激發(fā)光，用熒光顯微鏡觀察實驗結果，并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染效率理想；如果不帶熒光，可以用GFP來對照，放在一個單獨的孔中，或是與目標質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同時用Q-PCR、 WB、FCM來檢測。
轉(zhuǎn)染后，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以參考以下幾點：
1、復轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12 h-24 h再次進行轉(zhuǎn)染。前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。
2、通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)染成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
3、一般的瞬時轉(zhuǎn)染，隨著傳代的次數(shù)增多，轉(zhuǎn)染效率會隨著減低。
溫馨提醒：
如果您想要了解或選購細胞系或者原代細胞，請點擊我要選購，有任何疑問也可以點擊右方的在線咨詢，專業(yè)技術人員將為您提供解答。
