大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來(lái)源于中胚層，是具有多分化潛能的細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)表明，BMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能。在不同誘導(dǎo)條件下，可向中胚層細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等分化。BMSCs 是理想的種子細(xì)胞來(lái)源之一，在細(xì)胞替代治療、基因治療及組織器官再造中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的方法、注意事項(xiàng)及鑒定指標(biāo)，幫助您快速上手開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
分離提取步驟
1、骨髓取材
將大鼠斷頸處死后, 置于75%醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡5~10 min，消毒后將動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)至超凈工作臺(tái)內(nèi)。無(wú)菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，用新的剪刀鑷子清除股骨脛骨周圍肌肉組織；保持骨頭完整，留取純凈骨頭，將組織轉(zhuǎn)移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，剪去骨干的兩端, 暴露骨髓腔；取注射器，吸取培養(yǎng)基，從骨頭一端插針，沖洗骨髓（至骨頭發(fā)白透亮），反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。
2、分離方法
BMSCs常見(jiàn)的分離方法有密度梯度離心法、貼壁法以及免疫磁珠分選法，大家可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室條件來(lái)選擇合適的分離方法。
(1) 密度梯度離心法
將裝有大鼠骨髓液的15 mL離心管，1500rpm離心5 min；棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀；將培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液緩慢滴加到Percoll分離液（用PBS稀釋）上方，形成密度梯度分離液；2000~2500rpm離心25 min，吸取中間層的白色霧狀細(xì)胞層，加入PBS清洗細(xì)胞，1800rpm離心5 min；棄上清，保留細(xì)胞沉淀；用細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀，將細(xì)胞懸液按1×106/mL密度接種于T25瓶中，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。首次2d換液，棄去未貼壁細(xì)胞, 此后每2~3 d換液一次；待細(xì)胞融合達(dá)80%后, 用胰酶消化1~2 min后傳代培養(yǎng)。
(2) 貼壁法
也稱全骨髓培養(yǎng)法或一步法。將收集的骨髓懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液；培養(yǎng)48h首次換液，棄去未貼壁細(xì)胞；此后每2~3d換液一次，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及融合程度，待細(xì)胞融合80%以上后開(kāi)始傳代培養(yǎng)。
(3) 流式細(xì)胞儀或免疫磁珠分選法
免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法通過(guò)識(shí)別細(xì)胞表面特異性抗原分離細(xì)胞，可獲得純度較高的細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，獲得的細(xì)胞量少，需要特殊的儀器，實(shí)際應(yīng)用受限。
注意事項(xiàng)
取材嚴(yán)格無(wú)菌操作。除基本的無(wú)菌要求外,在剪取大鼠的雙下肢及剝離皮毛后，應(yīng)更換取材器械，避免取材和分離骨髓間的交叉污染；
培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)要充足。血清濃度可摸索調(diào)整，培養(yǎng)時(shí)可額外添加生長(zhǎng)因子；
采用密度梯度離心法時(shí)，Percoll分離液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。此外，分離液和細(xì)胞懸液的比例應(yīng)合適，一般采用1∶1；
注意細(xì)胞接種密度、換液時(shí)間。密度過(guò)低會(huì)影響細(xì)胞貼壁、融合。不同的操作方法中換液、傳代時(shí)間各異，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及時(shí)調(diào)整換液、傳代時(shí)間。
鑒定指標(biāo)
1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
剛分離提純的原代細(xì)胞形態(tài)呈圓形，大小不一，漂浮于培養(yǎng)液中（圖1）。經(jīng)純化貼壁后可見(jiàn)，細(xì)胞呈成纖維樣緊密排列，漩渦樣生長(zhǎng)，胞核大、清晰、呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一（圖2），其形態(tài)符合BMSCs的貼壁形態(tài)。
圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞剛分離，呈圓形
圖2 普諾賽實(shí)驗(yàn)室提純的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
2、表面標(biāo)志物
目前使用較多的是CD90、CD29、CD44等陽(yáng)性表達(dá)指標(biāo)。
普諾賽實(shí)驗(yàn)室提取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90表達(dá)
參考文獻(xiàn)
[1]Clavin, N. W., Fernandez, J., Schönmeyr, B. H., Soares, M. A., et al. Fractionated doses of ionizing radiation confer protection to mesenchymal stem cell pluripotency. Plastic and reconstructive surgery,2008;122(3),739–748. https://doi.org/10.1097/PRS.0b013e318180edaa
[2]Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., et al. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology,2018;93(1),19–31. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23242
[3]Li, X., Zhang, Y., & Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology, 2013;65(3), 323–334. https://doi.org/10.1007/s10616-012-9497-3
[4]段長(zhǎng)偉，柴彥杰，趙疆東，等．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)［J］．寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2021，43(6):573－576．
[5]宮宇，王鴻飛，夏海軍．全骨髓貼壁接觸培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［J］．中國(guó)組織工程研究，2014，18(1):51－56．
