轉(zhuǎn)染效率不高?那是因為你沒有掌握這些技巧......

轉(zhuǎn)染是將核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞中的過程，是細(xì)胞生物學(xué)、基因表達(dá)和基因抑制實驗中的關(guān)鍵步驟。在現(xiàn)代生命可持續(xù)研究中，大部分的工作是利用基因功能研究來探索生命過程，如何將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)是科學(xué)實驗過程中不可缺少的實驗技術(shù)，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟。

在實驗當(dāng)中，我們經(jīng)常遇到的一種情況就是轉(zhuǎn)染完細(xì)胞，去跑qpcr驗證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率太低以至于無法進(jìn)行后續(xù)的實驗......

那么，到底該如何選擇轉(zhuǎn)染方法?轉(zhuǎn)染中要注意的事項有哪些?轉(zhuǎn)染試劑該如何選擇?今天就一起為大家介紹一下。

轉(zhuǎn)染方法的選擇

　　我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導(dǎo)，化學(xué)介導(dǎo)，生物介導(dǎo)。

　　但實驗室使用較多的主要有化學(xué)介導(dǎo)中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)和生物介導(dǎo)中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。

　　其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，一般瞬時轉(zhuǎn)染選擇較多，但有些細(xì)胞系不容易轉(zhuǎn)染，因此選擇轉(zhuǎn)染方式時一定要做足功課，親身經(jīng)歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。

　　特別是養(yǎng)原代細(xì)胞的小伙伴，一點(diǎn)要認(rèn)真選擇!病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢，且其對原代細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中更分為慢病毒轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染，其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合更為難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如懸浮細(xì)胞、T細(xì)胞、raw細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的注意事項

　　1、細(xì)胞狀態(tài)

　　眾所周知，細(xì)胞的生長狀態(tài)影響實驗結(jié)果，原代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是最佳選擇，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞生長狀態(tài)最好，最適合轉(zhuǎn)染。同時，我們都知道細(xì)胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染前的密度，失敗過很多次的經(jīng)歷告訴大家，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度更加重要。有時候轉(zhuǎn)染時間太久，等到進(jìn)行后續(xù)實驗時細(xì)胞已經(jīng)肆意生長，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細(xì)胞的生長周期和轉(zhuǎn)染的時間進(jìn)行鋪板，建議選擇50%~80%區(qū)間密度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

　　2、實驗污染

　　跟細(xì)胞有關(guān)的實驗當(dāng)然要注意不能污染啦，細(xì)菌，真菌，支原體都是應(yīng)該嚴(yán)格注意的，不僅會浪費(fèi)試劑，也會影響實驗結(jié)果。

　　3、轉(zhuǎn)染試劑的處理

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：

　　1、質(zhì)粒的純度會影響轉(zhuǎn)染的效率，如果質(zhì)粒不純，其含有少量的鹽，蛋白會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染復(fù)合體的形成，因為內(nèi)毒素嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率，還需進(jìn)行質(zhì)粒內(nèi)毒素的處理。

　　2、其次如選用lipo2000或lipo3000，需注意嚴(yán)格按照說明書的加樣順序添加，其中mix well只需用槍輕輕混勻或手指輕輕晃動，切忌用力吹打，會導(dǎo)致脂質(zhì)體失去作用。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

　　根據(jù)不同的實驗需求，如需進(jìn)行劃痕、transwell等培養(yǎng)時間較長的實驗，最好使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，而如果只需檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)不用較長時間培養(yǎng)，選擇瞬轉(zhuǎn)即可。

　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一般是瞬時轉(zhuǎn)染，如需篩選穩(wěn)定株需要在藥物的作用下，因常用質(zhì)粒載體pcDNA3.1，其含有neomycin的基因，可選擇G418進(jìn)行篩選，根據(jù)教程需要提前對不同濃度的G418進(jìn)行細(xì)胞篩選，選擇最適篩選濃度，可以通過閱讀文獻(xiàn)，選擇一定的濃度區(qū)間大梯度進(jìn)行篩選，在全部存活和死亡較多的兩個濃度間再設(shè)定濃度梯度進(jìn)行篩選，這樣得出的篩選濃度更為準(zhǔn)確。

　　同時由于基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)需要一定時間才能夠表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，但如果轉(zhuǎn)染時間較長，細(xì)胞代謝時間較久，轉(zhuǎn)染細(xì)胞也會逐漸減少，因此要合理控制進(jìn)行篩選的時間。注意：藥物篩選時細(xì)胞密度不要太低，否則密度太低全部篩死就可以快樂地進(jìn)行下一次實驗了。

轉(zhuǎn)染效率的驗證

　　1、最有效的驗證方式必須是qPCR驗證；

　　2、熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標(biāo)記(一般是GFP)還是非熒光標(biāo)記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標(biāo)記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完全證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證最為準(zhǔn)確。

推薦——Procell Nanofecter轉(zhuǎn)染試劑

　　如果你嚴(yán)格按照實驗步驟來操作，最后轉(zhuǎn)染效率還是不高的話，推薦你選擇一款好的轉(zhuǎn)染試劑，普諾賽的Nanofecter轉(zhuǎn)染試劑是具有較高陽離子電荷密度的納米材料分子，能高效地包裹大分子DNA、小分子寡核苷酸、siRNA形成小的帶正電荷的納米復(fù)合物微粒，這些微粒可以高效的結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面殘基，并通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。Nanofecter含有的氨基在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生質(zhì)子化，使囊泡釋放復(fù)合物微粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，復(fù)合物解體后，DNA等核酸分子就能進(jìn)一步進(jìn)入到細(xì)胞核中，參與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

　　并且，此產(chǎn)品通過多種細(xì)胞測試和長期的實驗驗證，與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相比具有明顯的優(yōu)勢：

　　1、適用性廣，適用于大多數(shù)細(xì)胞，可用于DNA和RNA轉(zhuǎn)染;

　　2、轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可靠;

　　3、毒性低，對細(xì)胞狀態(tài)影響小，實驗結(jié)果更真實;

　　4、用量少，價格低，經(jīng)濟(jì)實惠。

案例展示：

1、使用Nanofecter轉(zhuǎn)染試劑，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染24h，如下：

2、使用Nanofecter轉(zhuǎn)染試劑，miRNA轉(zhuǎn)染6h，如下：

3、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染與Lipo2000效果對比，如下：

溫馨提醒：

　　其實細(xì)胞轉(zhuǎn)染并不困難，只要你規(guī)范操作，并且使用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，那么操作起來就得心應(yīng)手，如果您想了解或者選購上面的Nanofecter轉(zhuǎn)染試劑的話，請點(diǎn)擊我要選購。

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