實戰(zhàn)分享 | 骨髓源樹突狀細胞的提取和培養(yǎng)技巧分享

骨髓源樹突狀細胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDCs）是從小鼠或其他哺乳動物骨髓中分離，并經(jīng)過體外特定條件誘導分化得到的樹突狀細胞（DCs）。它們是免疫系統(tǒng)中重要的抗原呈遞細胞，能夠識別、攝取和處理抗原，并通過表面分子將抗原呈遞給T細胞，激活適應性免疫反應。因此，BMDCs是研究免疫反應、抗原呈遞和細胞免疫調控的關鍵工具。

本期，我們非常榮幸地聯(lián)系到了來自蘇州大學的繆老師，與我們分享他寶貴的科研經(jīng)驗。接下來是繆老師在BMDCs提取和培養(yǎng)過程中積累的豐富經(jīng)驗和深刻心得，一起來實戰(zhàn)學習吧！

? 作者單位：蘇州大學

? 發(fā)表期刊：Advanced Materials（IF=27.4）

? 文章標題：A Minimalist Pathogen-Like Sugar Nanovaccine for Enhanced Cancer Immunotherapy

? 引用普諾賽®產(chǎn)品：

一、實驗材料與試劑準備

實驗材料

01、小鼠（常用C57BL/6，雌性，6-12周齡）

02、T75培養(yǎng)瓶（未TC處理），10 cm和6 cm皿，1.5 mL、15 mL和50 mL離心管，1 mL無菌注射器（帶針）

03、提前滅菌（121℃，15-20 min）并干燥：剪刀、鑷子若干，手術刀片及刀柄（熟練掌握可用），細胞篩網(wǎng)/紗布（250目）

試劑

01、完全培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素）

02、細胞因子：GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，20 ng/mL），β-巰基乙醇（50 μM）

03、紅細胞裂解液：用于除去紅細胞

04、PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）：用于細胞的沖洗

05、棄上清，用2 mL緩沖液重懸細胞，再加緩沖液至40 mL，230×g離心6 min。

06、75%乙醇：用于活體消毒

07、流式抗體（CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40等）：用于細胞表型鑒定

二、骨髓源樹突狀細胞的提取步驟

小鼠安樂死與骨髓提取

01、使用二氧化碳吸入法或頸椎脫臼法將小鼠安樂死；

02、將小鼠浸泡于75%乙醇，移至無菌環(huán)境下進行后續(xù)操作；

03、在無菌條件下，將小鼠置于無菌大皿中，從75%乙醇中轉移至PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）。接下來，從背側將后腿部周圍一圈的皮肉分離（兩側均需要處理），以充分暴露兩側股骨；

04、使用手術剪分離盆骨與脊柱（注意不要剪斷股骨），并轉移至中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）；

05、使用手術鑷小心將皮毛與肌肉組織分離（拖拽至腳部即可）；

06、使用手術剪將脛骨周圍一圈的肌腱剪斷，使用兩把手術鑷分別固定腳部和脛骨，逆關節(jié)剝離，分離腳部和脛骨；

07、使用手術鑷小心將脛骨處肌肉組織縱向剝離至股骨方向，暴露膝關節(jié)；

08、同上操作，使用兩把手術鑷分別固定股骨和脛骨，逆關節(jié)剝離，分離股骨和脛骨；

09、通過適當?shù)牧Φ滥骊P節(jié)方向用力，將股骨從髖臼（骨盆的部分）中脫離，進而分離股骨與骨盆；

10、使用手術剪和鑷子仔細小心地將脛骨與股骨上的肌肉剝離，并暴露清晰完整的骨頭末端；

11、待取出完整的兩條脛骨和兩條股骨之后，使用鑷子固定骨頭，剪刀剪斷骨頭兩端，使用注射器吸取完全培養(yǎng)基，多次沖洗骨頭中骨髓細胞，直至骨頭發(fā)白無血紅色；

12、隨后將收集到的骨髓細胞重懸至15 mL離心管。

骨髓細胞處理與紅細胞去除

01將收集的骨髓細胞以1200 rpm離心3 min，去除上清；

02重懸于1 mL紅細胞裂解液中（37°C下處理1-3 min），輕柔混勻以裂解紅細胞；

03裂解后加入3 mL完全培養(yǎng)基中終止反應；

04隨后用細胞篩網(wǎng)或紗布過濾，去除骨屑和殘余組織，將濾液收集到離心管；

05再次1200 rpm離心3 min，去除裂解液。

三、樹突狀細胞的誘導與培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)（第0天）

01、將骨髓細胞重懸于含有GM-CSF和β-巰基乙醇的完全培養(yǎng)基中（1-3 mL），取少量細胞懸液稀釋100倍后計數(shù)；

02、將細胞接種在T75培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為1.5-2×107個/30 mL/瓶，37°C，5% CO2孵育。

培養(yǎng)與補液（第3天）

01、輕輕拍打培養(yǎng)瓶使得半粘附狀態(tài)的骨髓源細胞重懸以便于更好的與刺激因子接觸并分化；

02、加入30 mL新鮮的完全培養(yǎng)基（含等濃度的刺激因子），繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞收獲（第6天）

01、此時大多數(shù)細胞應已分化為未成熟的樹突狀細胞（未成熟樹突狀細胞通常表現(xiàn)為較低的表面MHC-II和共刺激分子表達，如CD80、CD86），輕輕拍打瓶身重懸半粘附狀態(tài)的細胞，吸取1 mL含細胞的培養(yǎng)基；

02、收獲的細胞進行PBS清洗，并通過流式細胞術染色鑒定；

03、BMDCs的標志物主要包括高表達的CD11c，以及MHC-II和共刺激分子（如CD80、CD86、CD40）的上調。以CD80、CD86為例，CD11c+細胞的比例在40%-60%，CD80+CD86+ in CD11c+ 細胞的比例在10%-20%，則代表分化程度和成熟度合適，可進行進一步實驗；

04、鑒定完之后，收集T75瓶中的細胞懸液，以1200 rpm離心3 min，去除上清。重懸至完全培養(yǎng)基（不含刺激因子），稀釋100倍計數(shù)，然后鋪板（未TC處理）可直接進行后續(xù)實驗；

05、以24孔板（未TC處理）為例，細胞濃度為0.5-1×106個/mL/孔，細胞在37°C，5% CO2孵育。

» 實驗中的關鍵技巧與注意事項

• 提取骨髓源細胞過程中嚴格保持無菌環(huán)境，避免細胞污染，否則可能導致BMDCs成熟度過高無法使用。

• 提取過程中盡量將小鼠腿部及分離出的骨骼浸泡在PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）中操作，避免長時間暴露在空氣中。

• 分離腿部后可在中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）中操作，每一步均可更換全新的中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）。

• 在剪斷骨頭和沖洗細胞過程中（這一步驟直接接觸細胞），需要使用滅菌后未被使用的剪刀和鑷子，避免使用在前面的分離過程中使用過的器械，以防止交叉污染。

• 脛骨上端可直接被針頭刺穿，可不剪，但需要檢查是否破損，且其余骨頭末端需要剪斷部分不宜過多，以減少細胞損傷和污染風險。注射器沖洗骨髓腔時，操作應反復輕柔，避免用力過猛導致細胞濺出或骨頭破裂。

• 如遇到骨頭破損或懷疑被污染的情況，可將這部分細胞單獨培養(yǎng)并進行鑒定，以免污染其他正常細胞。

• 裂紅時間需要控制得當，過長或過短都可能影響細胞質量。如遇到離心后仍有紅色細胞沉淀可再次裂紅，并酌情縮短裂紅時間。

• 正常小鼠兩條后腿提取的骨髓細胞量在3-6×107個（90 mL培養(yǎng)基，3瓶T75培養(yǎng)瓶），根據(jù)實驗需求調整培養(yǎng)基體積和容器大小。

• 細胞因子的濃度可根據(jù)實際情況有所調整。正常骨髓源樹突狀細胞增殖和分化能力有限，避免長時間反復刺激。

• BMDCs成熟度合適后應盡快使其脫離有刺激因子的培養(yǎng)基環(huán)境，在正常完全培養(yǎng)基中可存放1-3天，建議盡快使用，避免污染或過度成熟。

通過合理的培養(yǎng)條件與嚴謹?shù)牟僮髁鞒?，可以成功誘導并提取出骨髓源樹突狀細胞。實驗成功的關鍵在于控制細胞因子的濃度、及時補液以及細胞表型驗證。掌握這些細節(jié)可以顯著提高BMDCs培養(yǎng)的成功率，并確保所培養(yǎng)細胞具備期望的功能特性。

非常感謝繆老師關于BMDCs提取和培養(yǎng)過程的經(jīng)驗分享，希望這些經(jīng)驗能對大家的研究工作有所幫助。同時，我們也熱烈歡迎更多老師投稿，分享您在科研領域的干貨和心得體會，共同促進科研交流和進步！