永生化細(xì)胞：突破細(xì)胞“壽命枷鎖”，釋放科研無限可能！

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定且足量的細(xì)胞資源是各類研究的重要基礎(chǔ)。然而，常規(guī)細(xì)胞在傳代過程中會逐漸衰老，最終失去分裂能力，這一現(xiàn)象被稱為“Hayflick極限”（正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下通常只能分裂50-60次）。永生化細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，為科研提供了可無限傳代、性能穩(wěn)定的細(xì)胞。本期細(xì)胞學(xué)堂將帶你快速了解永生化細(xì)胞的基本原理與構(gòu)建流程，一起探索細(xì)胞研究的新邊界。

一、什么是永生化細(xì)胞

定義

永生化細(xì)胞（Cellular Immortalization）是指原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，通過自發(fā)突變或外源干預(yù)手段突破Hayflick極限，從而獲得可持續(xù)增殖能力的一類細(xì)胞。這類細(xì)胞通常能保留部分原代細(xì)胞的特性，在無其他致癌突變的前提下，一般不會自發(fā)癌變，但在長期培養(yǎng)中仍可能發(fā)生遺傳變異，因此需持續(xù)監(jiān)控其基因穩(wěn)定性。

原理

細(xì)胞永生化主要依賴將外源基因?qū)肽康募?xì)胞，以打破細(xì)胞衰老限制，賦予其持續(xù)增殖能力。目前常用的兩類關(guān)鍵基因是SV40大T抗原（TAg）、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）。

01、SV40大T抗原（TAg）

目前認(rèn)為，SV40大T抗原可與抑癌蛋白p53及其相關(guān)蛋白結(jié)合，形成復(fù)合體，從而使p53蛋白失活。p53的失活會阻斷細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受阻，導(dǎo)致抑癌信號失效，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入衰老或凋亡程序，促使宿主細(xì)胞獲得持續(xù)增殖能力，實(shí)現(xiàn)永生化。

02、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）

端粒對維持染色體穩(wěn)定性至關(guān)重要，其長度隨著細(xì)胞分裂逐漸縮短，當(dāng)縮短至臨界值時(shí)，細(xì)胞將會啟動(dòng)衰老程序。hTERT是端粒酶的核心催化亞基，能以端粒RNA為模板合成端粒DNA以延長端粒，維持染色體的穩(wěn)定性。然而，在正常細(xì)胞中，hTERT活性受表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄調(diào)控嚴(yán)格抑制，無法有效維持端粒長度。因此，激活hTERT是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化的重要策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)路徑：

如何將“特殊指令”送入細(xì)胞？

目前，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化最常用的方法是通過慢病毒或其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將編碼TAg 或 hTERT 基因序列穩(wěn)定整合到目的細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)持久表達(dá)。這一過程可有效打破細(xì)胞衰老機(jī)制，使細(xì)胞獲得持續(xù)增殖能力，并顯著延長其體外培養(yǎng)壽命。

關(guān)于慢病毒載體系統(tǒng)的優(yōu)勢與局限，我們在《玩轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記細(xì)胞系：從原理到構(gòu)建方法一網(wǎng)打盡》一文中進(jìn)行了解讀，感興趣的讀者可前往查閱。

應(yīng)用領(lǐng)域

永生化細(xì)胞因其持續(xù)增殖能力和相對穩(wěn)定的生物學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物醫(yī)藥開發(fā)及細(xì)胞工程等領(lǐng)域。常見應(yīng)用見表1。

表1. 永生化細(xì)胞的應(yīng)用

二、永生化細(xì)胞構(gòu)建簡易流程

細(xì)胞系選擇和狀態(tài)確認(rèn)

• 慢病毒包裝細(xì)胞：選擇HEK-293T，用于慢病毒的生產(chǎn)。應(yīng)處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好。

• 靶細(xì)胞：選擇目標(biāo)細(xì)胞，應(yīng)處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好。參考THLE-2、SV-HUC-1細(xì)胞系構(gòu)建方法。

慢病毒載體制備

• 將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（含TAg或hTERT及嘌呤霉素抗性標(biāo)記）、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒通過共轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入HEK-293T 細(xì)胞中，制備攜帶目的基因的重組慢病毒顆粒。

慢病毒感染

• MOI值優(yōu)化：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，確定兼顧較高感染效率與低毒性的最佳MOI值。

• 細(xì)胞培養(yǎng)：消化并收集狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，根據(jù)濃度稀釋細(xì)胞懸液至1x105/mL，取500 μL接種至24孔板中，37℃，5% CO2過夜培養(yǎng)。

• 感染操作：慢病毒置于冰上解凍，吸出原培養(yǎng)基后更換新的培養(yǎng)基，加入慢病毒（最佳MOI值），同時(shí)需要加入聚凝胺（終濃度為8 ug/mL）增強(qiáng)感染效率，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。

抗性篩選

• 抗生素濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)：通過設(shè)置嘌呤霉素梯度濃度篩選出最低致死細(xì)胞濃度，作為后續(xù)篩選工作濃度。

• 篩選過程：感染48 h后更換為新鮮含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，約每2-3天更換含嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)直至穩(wěn)定陽性細(xì)胞存活。

細(xì)胞鑒定

• 基因表達(dá)驗(yàn)證：采用qPCR檢測永生化相關(guān)基因的表達(dá)水平。

• 細(xì)胞功能評估：通過β-半乳糖苷酶染色評估細(xì)胞衰老狀態(tài)；連續(xù)傳代細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察其是否突破Hayflick極限。

• 表型穩(wěn)定性鑒定：通過免疫熒光檢測特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，評估永生化后細(xì)胞的穩(wěn)定性與純度。

三、注意事項(xiàng)

1、在病毒包裝過程中，核酸的質(zhì)量和純度對轉(zhuǎn)染效率影響顯著。建議質(zhì)粒濃度控制在400-1,000 ng/μL范圍內(nèi)，純度（A260/280)在1.8-2.0范圍內(nèi)。

2、在病毒使用過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，因其會顯著降低病毒滴度復(fù)凍融。建議按照每次的使用量進(jìn)行分裝。此外，若病毒儲存時(shí)間超過6個(gè)月，在使用前需重新測定病毒滴度以確保感染效率。

3、對于極難感染的細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞DC）等，可采用多次感染的方法。即感染24 h后，更換新鮮病毒進(jìn)行二次感染，可顯著提升感染效率。

4、永生化細(xì)胞相較于原代細(xì)胞，在增殖能力、細(xì)胞周期調(diào)控、端粒酶活性、遺傳穩(wěn)定性、表型和功能等方面可能發(fā)生顯著改變。這些改變使得永生化細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢（如無限增殖、穩(wěn)定性高），但也可能限制其在某些研究中的應(yīng)用（如生理?xiàng)l件模擬）。因此，在選擇細(xì)胞模型時(shí)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木C合評估永生化細(xì)胞和原代細(xì)胞的適用性。

5、永生化細(xì)胞理論上可以無限傳代，因?yàn)樗鼈兺黄屏薍ayflick極限，端粒酶活性維持了端粒長度，避免了復(fù)制性衰老。但在長期傳代中遺傳不穩(wěn)定可能導(dǎo)致細(xì)胞積累突變，影響其表型和功能。其次培養(yǎng)基成分、血清質(zhì)量、傳代操作等可能影響細(xì)胞狀態(tài)。此外，細(xì)胞系間存在特異性，不同細(xì)胞系的穩(wěn)定性不同，部分永生化細(xì)胞可能在長期培養(yǎng)過程中出現(xiàn)表型衰退或特性改變的情況。

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