熒光標(biāo)記細(xì)胞系：原理、應(yīng)用與慢病毒載體構(gòu)建全流程指南
在生命科學(xué)的微觀世界里，熒光素標(biāo)記細(xì)胞技術(shù)憑借其高靈敏度和高特異性，能夠在不破壞細(xì)胞正常生理功能的前提下，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的精準(zhǔn)觀察。它正逐漸成為我們探索細(xì)胞奧秘的得力助手，為生命科學(xué)研究帶來了前所未有的突破。本期細(xì)胞學(xué)堂，讓我們一同走進(jìn)這個(gè)被熒光點(diǎn)亮的細(xì)胞世界。
一、熒光標(biāo)記細(xì)胞系的定義、用途與原理
定義：熒光標(biāo)記細(xì)胞是指將熒光蛋白或熒光素酶報(bào)告基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞狀態(tài)、行為或分子過程的可視化追蹤。常用的熒光蛋白包括綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）等。
用途：熒光標(biāo)記細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域，常見用途見表1。
表1. 熒光細(xì)胞系的應(yīng)用
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方法 |
應(yīng)用方向 |
具體說明 |
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標(biāo)記腫瘤細(xì)胞 |
疾病模型構(gòu)建 |
構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移模型，觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移與增殖 |
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結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng) |
基因編輯驗(yàn)證 |
通過引入熒光標(biāo)簽篩選基因編輯成功的細(xì)胞（如同源重組） |
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監(jiān)測熒光強(qiáng)度變化 |
藥物篩選與毒性評估 |
評估藥物對細(xì)胞增殖、凋亡或特定靶點(diǎn)的影響（如熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)） |
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活體成像、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) |
細(xì)胞追蹤或示蹤 |
用于研究干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的遷移、分化等過程 |
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建立持續(xù)表達(dá)熒光基因的細(xì)胞系 |
穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建 |
用于基因功能研究、信號通路分析，藥物篩選 |
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熒光蛋白與特定啟動子偶聯(lián)（NF-kB啟動子） |
動態(tài)檢測基因表達(dá) |
實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞狀態(tài)或信號通路變化 |
原理：熒光標(biāo)記細(xì)胞系的構(gòu)建通常通過慢病毒載體介導(dǎo)，具體過程如下：
» 構(gòu)建攜帶熒光蛋白（如GFP、mCherry）或報(bào)告基因（如Luciferase）的慢病毒載體，進(jìn)行病毒包裝以獲得具有感染性的慢病毒顆粒。
» 慢病毒通過VSV-G包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜上的磷脂成分發(fā)生非特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒內(nèi)吞。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒釋放RNA基因組，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄為前病毒DNA，在整合酶作用下期隨機(jī)整合到宿主基因組中，實(shí)現(xiàn)熒光蛋白基因的表達(dá)。
» 最后通過抗生素（如嘌呤霉素）篩選或流式細(xì)胞術(shù)分選表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，建立熒光細(xì)胞系。
二、慢病毒載體在熒光標(biāo)記中的優(yōu)勢與局限
優(yōu)勢
» 慢病毒具有廣泛的宿主范圍，可有效地感染分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞。
» 針對原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，以及對腺病毒具有較強(qiáng)免疫反應(yīng)的細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞），慢病毒可顯著提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及整合效率。
» 慢病毒載體具有低免疫原性，直接注射活體組織不易引發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，適用于動物實(shí)驗(yàn)。
» 可在慢病毒載體中插入組織/細(xì)胞特異性的啟動子和增強(qiáng)子（如神經(jīng)元啟動子），增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的靶向性，使其在特定細(xì)胞中表達(dá)。
局限
盡管慢病毒載體具有諸多優(yōu)勢，但在生物安全性及病毒滴度方面仍存在一定局限性。目前常用的慢病毒載體是基于HIV-1，采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，通過刪除包裝信號并引入外源性目的基因，構(gòu)建為不能自我復(fù)制，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新病毒顆粒的假型病毒。但由于慢病毒自然宿主是人，仍存在潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)。因此，優(yōu)化載體結(jié)構(gòu)、提升病毒滴度是實(shí)現(xiàn)其更加廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵方向。
三、GFP標(biāo)記細(xì)胞系的簡易流程
1. 細(xì)胞系選擇和狀態(tài)確認(rèn)
» 慢病毒包裝細(xì)胞：選擇HEK-293T（貨號： CL-0005），用于慢病毒的生產(chǎn)。細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好。
» 靶細(xì)胞：選擇目標(biāo)細(xì)胞系[如A549（貨號： CL-0016）、Hep G2（貨號： CL-0103）]，應(yīng)處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好。
2. 慢病毒制備
使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒（包括Transfer質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染入HEK-293T細(xì)胞中，制備攜帶GFP表達(dá)和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒顆粒。
3. 慢病毒感染接種與傳代
» MOI值優(yōu)化：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，確定兼顧較高感染效率與低毒性的最佳MOI值。
» 細(xì)胞準(zhǔn)備與接種：消化并收集狀態(tài)良好的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)板中（一般細(xì)胞接種密度為1x105 cells/mL），37℃，5% CO2過夜培養(yǎng)。
» 感染操作：冰上解凍慢病毒；更換為新鮮培養(yǎng)基，加入慢病毒（最佳MOI值）和聚凝胺（一般濃度8 μg/mL）；繼續(xù)培養(yǎng)過夜。
4. 抗性篩選
» 抗生素濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)：通過設(shè)置嘌呤霉素梯度濃度篩選出最低致死細(xì)胞素濃度，作為后續(xù)篩濃度。
» 篩選過程：感染48 h后更換為含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，篩選陽性克隆，每2-3天替換新鮮篩選培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)直至穩(wěn)定陽性細(xì)胞存活。
5. 細(xì)胞擴(kuò)增與維持
» 待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。
» 每2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，以維持轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽性表達(dá)。
6. 陽性細(xì)胞驗(yàn)證與凍存
» 流式細(xì)胞術(shù)分析GFP表達(dá)陽性率。
» 確認(rèn)陽性率達(dá)標(biāo)后，更換為正常完全培養(yǎng)基。
» 進(jìn)行細(xì)胞凍存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
四、案例分享
依據(jù)上述步驟，將慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒導(dǎo)入到HEK-293T細(xì)胞中，成功獲得攜帶GFP基因的慢病毒（見圖1）。所得慢病毒隨后用于感染A549與Hep G2細(xì)胞。
在感染前，我們確立了A549和Hep G2細(xì)胞對嘌呤霉素的敏感性曲線，通過在培養(yǎng)孔中加入不同濃度的嘌呤霉（0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL）確定能使細(xì)胞全部死亡的最低濃度，用作后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選濃度。結(jié)果顯示，A549、Hep G2細(xì)胞的最小致死濃度均為1.5 μg/mL時(shí)（見圖2）。最后按照殺滅曲線確定的濃度成功篩選出GFP+克?。ㄒ妶D3）。
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圖1 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的熒光效果
（左：40× ；右100×）
| A549 | Hep G2 | |
| 0 μg/mL |  |
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| 0.5 μg/mL |  |
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| 1.0 μg/mL |  |
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| 1.5 μg/mL |  |
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| 2.0 μg/mL |  |
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圖2 不同濃度嘌呤霉素處理A549、Hep G2細(xì)胞72 h后的細(xì)胞狀態(tài)（100×）
（A）0 ug/mL時(shí)，細(xì)胞幾乎無死亡
（B）puro為0.5 ug/mL時(shí)，少量細(xì)胞死亡
（C）puro為1 ug/mL時(shí)，只有少許細(xì)胞存活
（D）puro為1.5 ug/mL時(shí)，約100%細(xì)胞死亡
（E）puro為2 ug/mL時(shí)，約100%細(xì)胞死亡
| A549 |  |
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| Hep G2 |  |
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圖3 A549和Hep G2經(jīng)嘌呤霉素篩選的熒光蛋白表達(dá)水平（左：熒光圖，100×；右：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果）
五、注意事項(xiàng)
• 病毒包裝過程中，核酸的質(zhì)量和純度對轉(zhuǎn)染效率影響顯著。建議質(zhì)粒濃度控制在400-1,000 ng/μL范圍，純度（A260/280）在1.8-2.0范圍內(nèi)。
• 在病毒使用過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，因其會顯著降低病毒滴度。建議按照每次使用量進(jìn)行分裝。此外若病毒儲存超過6個(gè)月，建議在使用前重新測定滴度。
• 對于極難感染的細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞DC），可采用多次感染的方法。即感染24 h后，更換新鮮病毒進(jìn)行二次感染，可顯著提升感染效率。
• 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建議每5-10代采用流式細(xì)胞術(shù)檢測一次熒光表達(dá)水平，具體頻率可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和熒光標(biāo)記方法調(diào)整。此外，通過選擇添加壓力（如G418、嘌呤霉素篩選）、優(yōu)化培養(yǎng)條件和定期凍存，可延長熒光信號的穩(wěn)定性。
以上是關(guān)于熒光標(biāo)記細(xì)胞系詳細(xì)介紹及構(gòu)建方法的分享。更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
