細胞學堂 | 外泌體提取、鑒定方法
外泌體(Exosome) 指包含了復雜RNA和蛋白質(zhì)的膜性囊泡，其直徑在30-150nm左右。存在于所有生物體液中，包括血液、唾液、尿液、滑液、羊水、乳汁、細胞培養(yǎng)液等。不論是正常細胞還是腫瘤細胞，都能夠產(chǎn)生外泌體。
外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，具有脂質(zhì)雙分子層結構；此外，外泌體還含有蛋白質(zhì)和核酸。不同細胞來源的外泌體中所含有的生物分子具有細胞種屬特異性，其外泌體特異性與來源細胞相符合。
外泌體提取方法
● 超速離心法：
目前外泌體分離的金標準，且為外泌體提取的最常用方法，方法成熟，適用于大體積樣本。
● 沉淀法：
操作簡單，快速，回收率高。
● 超濾法：
操作簡單省時，可在低轉(zhuǎn)速下得到外泌體，不影響外泌體的生物活性。
● 親和層析法：
保證外泌體形態(tài)完整，特異性高，操作簡單，無需特殊昂貴的儀器設備。
上述幾種方法，方法一、二、三提取的純度不夠，方法四提取的量不夠，我們可以將這兩組方法綜合起來，先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌體，再用方法四提純外泌體。
外泌體獲取
| 樣本類型 | 樣本體積 | NTA顆粒數(shù)（Particles/mL） |
粒徑分布nm | 蛋白量（ug） |
| 細胞上清 | 1mL | 108-109 | 90-130 | ~10 |
| 血液 | 1mL | 1010-1011 | 60-100 | 200-400 |
外泌體鑒定
據(jù)國際細胞外囊泡學會（ISEV）在2014年的提議，外泌體鑒定3個標志：透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）、粒徑（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、蛋白標志物（Western Blot, WB）。
TEM：
外泌體透射電鏡分辨率為0.1~0.2nm，適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察，可觀測樣本中是否存在外泌體樣結構（通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，如圖1），同時可測量外泌體大小。
圖1. 電鏡下的外泌體結構
NTA：
該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
WB：
外泌體Western blot檢測可含內(nèi)參檢測，外泌體中的β-Actin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低，外泌體WB檢測時可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱。
外泌體應用
1、外泌體作為藥物載體，實現(xiàn)靶向給藥。外泌體具有負載“貨物“并將其傳遞給靶細胞的能力, 可用于細胞間通訊，尤其是遠距離通訊。以外泌體作為藥物轉(zhuǎn)運載體，具有免疫源性低、運輸效率高、穩(wěn)定性好和靶向性強以及能跨越血腦屏障等獨特優(yōu)勢。外泌體也適合遞送各種化學物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等。Buller B等將負載 miR-146的外泌體注射至患有角質(zhì)細胞瘤小鼠的腫瘤部位，發(fā)現(xiàn)miR-NAs有效的抑制了腫瘤的生長。
2、疾病診斷的分子標志物。不同疾病的不同類型細胞都能分泌含有不同miRNAs和RNAs的外泌體，使得從病人的體液中分離外泌體作為疾病診斷成為可能，尤其在腫瘤診斷中。除此之外，外泌體還可以應用于非腫瘤疾病的診斷。Welker M W等研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體CD81可能是慢性丙型肝炎診斷的潛在蛋白標志物。
3、促進組織修復和再生。近年的研究發(fā)現(xiàn)，干細胞來源外泌體是干細胞旁分泌活動的一種重要方式，可介導其促進組織再生。Chen等發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exo 的聯(lián)合治療可減少大鼠急性缺血性卒中的梗死面積，促進神經(jīng)功能恢復。ADSCs-exo可以避免干細胞治療的免疫排斥、倫理問題等缺點，且具有高穩(wěn)定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優(yōu)勢，與單一的細胞因子比較，具有較高的安全性和更大的組織再生潛能。
參考文獻
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