實(shí)戰(zhàn)分享 | 骨髓源樹突狀細(xì)胞的提取和培養(yǎng)技巧分享
骨髓源樹突狀細(xì)胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDCs）是從小鼠或其他哺乳動(dòng)物骨髓中分離，并經(jīng)過體外特定條件誘導(dǎo)分化得到的樹突狀細(xì)胞（DCs）。它們是免疫系統(tǒng)中重要的抗原呈遞細(xì)胞，能夠識(shí)別、攝取和處理抗原，并通過表面分子將抗原呈遞給T細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，BMDCs是研究免疫反應(yīng)、抗原呈遞和細(xì)胞免疫調(diào)控的關(guān)鍵工具。
本期，我們非常榮幸地聯(lián)系到了來自蘇州大學(xué)的繆老師，與我們分享他寶貴的科研經(jīng)驗(yàn)。接下來是繆老師在BMDCs提取和培養(yǎng)過程中積累的豐富經(jīng)驗(yàn)和深刻心得，一起來實(shí)戰(zhàn)學(xué)習(xí)吧！
? 作者單位：蘇州大學(xué)
? 發(fā)表期刊：Advanced Materials（IF=27.4）
? 文章標(biāo)題：A Minimalist Pathogen-Like Sugar Nanovaccine for Enhanced Cancer Immunotherapy
? 引用普諾賽®產(chǎn)品：
| 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
| PB180120 | 青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)，100× |
| PB180325 | HEPES液(1M) |
一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)材料
01、小鼠（常用C57BL/6，雌性，6-12周齡）
02、T75培養(yǎng)瓶（未TC處理），10 cm和6 cm皿，1.5 mL、15 mL和50 mL離心管，1 mL無菌注射器（帶針）
03、提前滅菌（121℃，15-20 min）并干燥：剪刀、鑷子若干，手術(shù)刀片及刀柄（熟練掌握可用），細(xì)胞篩網(wǎng)/紗布（250目）
試劑
01、完全培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素）
02、細(xì)胞因子：GM-CSF（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，20 ng/mL），β-巰基乙醇（50 μM）
03、紅細(xì)胞裂解液：用于除去紅細(xì)胞
04、PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）：用于細(xì)胞的沖洗
05、棄上清，用2 mL緩沖液重懸細(xì)胞，再加緩沖液至40 mL，230×g離心6 min。
06、75%乙醇：用于活體消毒
07、流式抗體（CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40等）：用于細(xì)胞表型鑒定
二、骨髓源樹突狀細(xì)胞的提取步驟
小鼠安樂死與骨髓提取
01、使用二氧化碳吸入法或頸椎脫臼法將小鼠安樂死；
02、將小鼠浸泡于75%乙醇，移至無菌環(huán)境下進(jìn)行后續(xù)操作；
03、在無菌條件下，將小鼠置于無菌大皿中，從75%乙醇中轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）。接下來，從背側(cè)將后腿部周圍一圈的皮肉分離（兩側(cè)均需要處理），以充分暴露兩側(cè)股骨；
04、使用手術(shù)剪分離盆骨與脊柱（注意不要剪斷股骨），并轉(zhuǎn)移至中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）；
05、使用手術(shù)鑷小心將皮毛與肌肉組織分離（拖拽至腳部即可）；
06、使用手術(shù)剪將脛骨周圍一圈的肌腱剪斷，使用兩把手術(shù)鑷分別固定腳部和脛骨，逆關(guān)節(jié)剝離，分離腳部和脛骨；
07、使用手術(shù)鑷小心將脛骨處肌肉組織縱向剝離至股骨方向，暴露膝關(guān)節(jié)；
08、同上操作，使用兩把手術(shù)鑷分別固定股骨和脛骨，逆關(guān)節(jié)剝離，分離股骨和脛骨；
09、通過適當(dāng)?shù)牧Φ滥骊P(guān)節(jié)方向用力，將股骨從髖臼（骨盆的部分）中脫離，進(jìn)而分離股骨與骨盆；
10、使用手術(shù)剪和鑷子仔細(xì)小心地將脛骨與股骨上的肌肉剝離，并暴露清晰完整的骨頭末端；
11、待取出完整的兩條脛骨和兩條股骨之后，使用鑷子固定骨頭，剪刀剪斷骨頭兩端，使用注射器吸取完全培養(yǎng)基，多次沖洗骨頭中骨髓細(xì)胞，直至骨頭發(fā)白無血紅色；
12、隨后將收集到的骨髓細(xì)胞重懸至15 mL離心管。
骨髓細(xì)胞處理與紅細(xì)胞去除
01將收集的骨髓細(xì)胞以1200 rpm離心3 min，去除上清；
02重懸于1 mL紅細(xì)胞裂解液中（37°C下處理1-3 min），輕柔混勻以裂解紅細(xì)胞；
03裂解后加入3 mL完全培養(yǎng)基中終止反應(yīng)；
04隨后用細(xì)胞篩網(wǎng)或紗布過濾，去除骨屑和殘余組織，將濾液收集到離心管；
05再次1200 rpm離心3 min，去除裂解液。
三、樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)與培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)（第0天）
01、將骨髓細(xì)胞重懸于含有GM-CSF和β-巰基乙醇的完全培養(yǎng)基中（1-3 mL），取少量細(xì)胞懸液稀釋100倍后計(jì)數(shù)；
02、將細(xì)胞接種在T75培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度為1.5-2×107個(gè)/30 mL/瓶，37°C，5% CO2孵育。
培養(yǎng)與補(bǔ)液（第3天）
01、輕輕拍打培養(yǎng)瓶使得半粘附狀態(tài)的骨髓源細(xì)胞重懸以便于更好的與刺激因子接觸并分化；
02、加入30 mL新鮮的完全培養(yǎng)基（含等濃度的刺激因子），繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞收獲（第6天）
01、此時(shí)大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)已分化為未成熟的樹突狀細(xì)胞（未成熟樹突狀細(xì)胞通常表現(xiàn)為較低的表面MHC-II和共刺激分子表達(dá)，如CD80、CD86），輕輕拍打瓶身重懸半粘附狀態(tài)的細(xì)胞，吸取1 mL含細(xì)胞的培養(yǎng)基；
02、收獲的細(xì)胞進(jìn)行PBS清洗，并通過流式細(xì)胞術(shù)染色鑒定；
03、BMDCs的標(biāo)志物主要包括高表達(dá)的CD11c，以及MHC-II和共刺激分子（如CD80、CD86、CD40）的上調(diào)。以CD80、CD86為例，CD11c+細(xì)胞的比例在40%-60%，CD80+CD86+ in CD11c+ 細(xì)胞的比例在10%-20%，則代表分化程度和成熟度合適，可進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；
04、鑒定完之后，收集T75瓶中的細(xì)胞懸液，以1200 rpm離心3 min，去除上清。重懸至完全培養(yǎng)基（不含刺激因子），稀釋100倍計(jì)數(shù)，然后鋪板（未TC處理）可直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
05、以24孔板（未TC處理）為例，細(xì)胞濃度為0.5-1×106個(gè)/mL/孔，細(xì)胞在37°C，5% CO2孵育。
» 實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵技巧與注意事項(xiàng)
• 提取骨髓源細(xì)胞過程中嚴(yán)格保持無菌環(huán)境，避免細(xì)胞污染，否則可能導(dǎo)致BMDCs成熟度過高無法使用。
• 提取過程中盡量將小鼠腿部及分離出的骨骼浸泡在PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）中操作，避免長時(shí)間暴露在空氣中。
• 分離腿部后可在中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）中操作，每一步均可更換全新的中皿（PBS緩沖液含1%青霉素/鏈霉素）。
• 在剪斷骨頭和沖洗細(xì)胞過程中（這一步驟直接接觸細(xì)胞），需要使用滅菌后未被使用的剪刀和鑷子，避免使用在前面的分離過程中使用過的器械，以防止交叉污染。
• 脛骨上端可直接被針頭刺穿，可不剪，但需要檢查是否破損，且其余骨頭末端需要剪斷部分不宜過多，以減少細(xì)胞損傷和污染風(fēng)險(xiǎn)。注射器沖洗骨髓腔時(shí)，操作應(yīng)反復(fù)輕柔，避免用力過猛導(dǎo)致細(xì)胞濺出或骨頭破裂。
• 如遇到骨頭破損或懷疑被污染的情況，可將這部分細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定，以免污染其他正常細(xì)胞。
• 裂紅時(shí)間需要控制得當(dāng)，過長或過短都可能影響細(xì)胞質(zhì)量。如遇到離心后仍有紅色細(xì)胞沉淀可再次裂紅，并酌情縮短裂紅時(shí)間。
• 正常小鼠兩條后腿提取的骨髓細(xì)胞量在3-6×107個(gè)（90 mL培養(yǎng)基，3瓶T75培養(yǎng)瓶），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整培養(yǎng)基體積和容器大小。
• 細(xì)胞因子的濃度可根據(jù)實(shí)際情況有所調(diào)整。正常骨髓源樹突狀細(xì)胞增殖和分化能力有限，避免長時(shí)間反復(fù)刺激。
• BMDCs成熟度合適后應(yīng)盡快使其脫離有刺激因子的培養(yǎng)基環(huán)境，在正常完全培養(yǎng)基中可存放1-3天，建議盡快使用，避免污染或過度成熟。
通過合理的培養(yǎng)條件與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮髁鞒?，可以成功誘導(dǎo)并提取出骨髓源樹突狀細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于控制細(xì)胞因子的濃度、及時(shí)補(bǔ)液以及細(xì)胞表型驗(yàn)證。掌握這些細(xì)節(jié)可以顯著提高BMDCs培養(yǎng)的成功率，并確保所培養(yǎng)細(xì)胞具備期望的功能特性。
非常感謝繆老師關(guān)于BMDCs提取和培養(yǎng)過程的經(jīng)驗(yàn)分享，希望這些經(jīng)驗(yàn)?zāi)軐?duì)大家的研究工作有所幫助。同時(shí)，我們也熱烈歡迎更多老師投稿，分享您在科研領(lǐng)域的干貨和心得體會(huì)，共同促進(jìn)科研交流和進(jìn)步！
