細胞消化經(jīng)驗總結(jié)：你的細胞消化好了嗎?
細胞培養(yǎng)，是一件需要不斷積累的實驗室必備技能，細胞消化是細胞培養(yǎng)中不是那么復雜的一個步驟，雖然這個步驟不難，但是還是有很多人會“栽”在這一步上，比如對一些增殖比較快的細胞來說，如果你沒有掌握好細胞消化的時間，那么，這些細胞就很有可能會由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏或者細胞接觸性抑制而導致狀態(tài)變差或死亡，這樣你的實驗就不可避免的延期了，所以，細胞消化也需要我們好好去探索一番。
細胞什么時候需要消化?
一般細胞長至80%-90%密度則需要傳代消化，貼壁細胞傳代前，需要把細胞用消化試劑從培養(yǎng)容器表面解離出來，細胞得以分離成單個懸液傳代至含新鮮培養(yǎng)基的新容器內(nèi)。
細胞消化的方法主要有四種：
一、酶消化法
這個方法是用得最多的，主要是用胰蛋白酶，一般濃度在0.25-0.5% ，消化的時間根據(jù)細胞種類、作用溫度等因素而變化，一般是從從幾分鐘到幾十分鐘不等。
一般來說，0.25% 的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下消化1-5 分鐘就足夠了。
需要注意的是，Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、 Mg2+ ，含EDTA的胰酶活性更高;
最后，可用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化。胰酶對溫度敏感，需在-20℃運輸和保存，不能反復凍融。
二、離子螯合劑
離子螯合劑不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
一般用得最多的是EDTA，一般濃度在0.02% 左右，作用于細胞與間質(zhì)，對細胞間也有一定作用。
注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶，因此配制時應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度，
這種方法相對來說操作簡單，無需使用蛋白或血清終止。
三、物理法
也就是直接吹打或用細胞刮子將細胞刮下來。
四、冷凍法
這種僅能用于細胞傳代時，因為它無法使組織上的細胞脫落下來。本方法的原理，主要是因細胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來。優(yōu)點是：對細胞損傷小，不需要中止或洗細胞，也不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細胞，不足是細胞可能會常小片脫落。
細胞的狀態(tài)怎么樣才算消化好了?
?、俨皇羌毎植己茈x散的單個圓形才算消化好了
一般顯微鏡觀察貼壁細胞，只要能移動了，多半呈沙狀移動，其實已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細胞消化或者吹打成完全分離細胞，這是沒有必要的。一般能移動了， 說明細胞之間，細胞與培養(yǎng)皿之間的附著已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了(雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布)，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。
②不是所有細胞消化后都會變成圓形
有些細胞(比如U87，U251)消化好了也不會變成圓形，只是呈半沙狀。
?、塾行┘毎词棺儓A，也有脫落的細胞，但還是沒消化好
比如7860，要等到大部分細胞脫落培養(yǎng)皿底部才可以停止消化，否則很難吹打下來，這種情況一般發(fā)生于難以消化的細胞。
?、軐τ谝恍┨厥獾募毎枰^一點
有些細胞吹成單個細胞反而對細胞的狀態(tài)會好一點，一但成團，細胞狀態(tài)立馬變差，比如LNCAP細胞。
消化過度的主要特征有哪些?
會導致相當一部分細胞損傷和死亡，剛傳代后的培養(yǎng)液表面漂浮細胞團，肉眼可見漂著小片白色膜狀物。如果細胞團中都是死細胞，則不會貼壁。如果細胞團中仍存在有活力的細胞，就會貼壁造成局部細胞密度不均勻，該局部較快形成中央壞死細胞區(qū)。
細胞消化過度怎么處理?
馬上用培養(yǎng)基中和，用吸管吹打細胞， 收集全部的細胞到以無菌的離心管中800RPM 3 分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)!! 狀態(tài)不好的細胞在培養(yǎng)的過程中會死亡脫落，在換液的時候可以清除掉!!
細胞消化不下來是什么情況?
(1)有些細胞貼壁比較牢，因此每次消化吹打之后總會剩下一些細胞，或者細胞長得較好而培養(yǎng)瓶太久沒換，為了顧全大部分有活力的細胞，細胞消化要適可而止。
(2)不同種類的細胞所需消化時間也不同。因為貼壁細胞的消化一般在2分鐘左右，對于個別出現(xiàn)的細胞難以消化，經(jīng)過多次消化和反復吹打之后仍無效，就放棄吧。
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